導(dǎo)讀：選取4種從石油污染土壤中分離出的石油降解菌包括根瘤菌、節(jié)細(xì)菌、嗜鹽菌和芽孢桿菌，對(duì)模擬石油污染土壤進(jìn)行了微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)。考察了4種菌單獨(dú)使用時(shí)的石油降解率，確定了混合菌的最佳配比和菌群的最優(yōu)培養(yǎng)。條件，并對(duì)比了微生物修復(fù)前后土壤的各項(xiàng)性質(zhì)。
石油及其制品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和使用過程中產(chǎn)生的大量石油污染物進(jìn)入環(huán)境，對(duì)土壤造成了嚴(yán)重污染，因此對(duì)石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術(shù)中，與物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)技術(shù)因其修復(fù)效果好、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、降解過程迅速和無二次污染等特點(diǎn)，被廣泛采用。微生物修復(fù)技術(shù)的本質(zhì)是通過微生物的代謝活動(dòng)將污染物降解，修復(fù)過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復(fù)效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。
相比于正交設(shè)計(jì)，均勻設(shè)計(jì)的主要優(yōu)勢(shì)是：在因素和水平數(shù)均較多的情況下，用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)就可獲得期望的結(jié)果，節(jié)省人力和物力，便于實(shí)施。目前，國(guó)內(nèi)還少見將均勻設(shè)計(jì)法用于石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研究報(bào)道。本工作采用從東營(yíng)石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對(duì)模擬石油污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步從理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量方面比較了土壤經(jīng)微生物修復(fù)前后的變化，為東營(yíng)石油污染土壤微生物修復(fù)的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供了技術(shù)參考和理論支持。
1、實(shí)驗(yàn)部分
1.1材料、試劑和儀器
原油：山東省東營(yíng)市某煉油廠；土壤：山東省東營(yíng)市東營(yíng)未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經(jīng)破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質(zhì)量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲(chǔ)存在滅菌牛皮紙袋內(nèi)冷藏備用。
LB培養(yǎng)基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節(jié)細(xì)菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實(shí)驗(yàn)室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。
PHS-3型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；
721型可見光分光光度計(jì)：北京光學(xué)儀器廠。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.14種單菌與土著微生物石油降解率的比較
采用LB培養(yǎng)基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個(gè)錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個(gè)。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對(duì)照樣考察土著微生物的修復(fù)作用。每間隔一段時(shí)間取樣，采用重量法測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。
1.2.2優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定
對(duì)4種菌進(jìn)行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率，從而構(gòu)建出優(yōu)勢(shì)菌群。采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的配比進(jìn)行優(yōu)化。
1.2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取
5個(gè)影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設(shè)計(jì)考察各因素對(duì)修復(fù)效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。
1.3分析方法
1.3.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法
采用電位法測(cè)定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測(cè)定模擬土樣的有機(jī)質(zhì)含量；半微量凱氏法測(cè)定模擬土樣的總氮含量；鉬銻抗比色法測(cè)定模擬土樣的總磷含量。
1.3.2土壤酶活性及微生物種群數(shù)量的測(cè)定
采用TTC法測(cè)定模擬土樣中脫氫酶的活性，奈氏比色法測(cè)定脲酶的活性，鄰苯三酚比色法測(cè)定多酚氧化酶的活性，高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶的活性；采用菌落形成單位CFU計(jì)數(shù)測(cè)定土壤的微生物種群數(shù)量。
2、結(jié)果與討論
2.14種單菌與土著微生物對(duì)石油降解率的影響
4種單菌與土著微生物對(duì)石油降解率的影響見圖1。由圖可見：使用4種單菌時(shí)石油降解率的高低順序?yàn)镈>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌處理40d后，石油降解率達(dá)30.08%，而土著微生物處理40d培養(yǎng)后的石油降解率僅為5.02%。
2.2優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定
混合菌的配比對(duì)石油降解率的影響見表1。由表1可見，當(dāng)A，B，C，D4種菌混合使用時(shí)，石油降解率最高，達(dá)到40.02%。
采用U11（114）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定A，B，C，D4種菌的最佳配比。U11（114）均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2，其中：X1為A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X2為B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X3為C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X4為D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
U11（114）均勻?qū)嶒?yàn)的數(shù)據(jù)處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（1）。
方差分析表中顯著性水平為0.009<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。混合菌的最佳配比為：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，預(yù)測(cè)最高石油降解率為54.30%。在最佳配比條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，石油降解率為54.50%，與預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差為0.37%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的菌種配比準(zhǔn)確可信。
2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
采用U14（148）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究各培養(yǎng)條件對(duì)石油降解率的影響。U14（148）均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表3。其中：U1為混合菌接種量，U2為土壤含水率，U3為雞糞加入量，U4為麥糠加入量，U5為表面活性劑加入量。
U14（148）均勻?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)的處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（2）。
方差分析表中顯著性水平為0.001<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg，預(yù)測(cè)最高石油降解率為67.35%。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，石油降解率為66.95%，與預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差為0.59%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的菌群培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可信。
2.4微生物修復(fù)前后土壤性質(zhì)的對(duì)比
分別將未經(jīng)處理的模擬土樣、經(jīng)土著微生物通風(fēng)堆肥法處理的模擬土樣、經(jīng)混合菌處理（最佳配比及最優(yōu)培養(yǎng)條件下）的模擬土樣記作M1，M2，M3，考察微生物修復(fù)前后土壤理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量的變化。經(jīng)過不同處理的模擬土樣的性質(zhì)見表4。
由表4可見，M3的修復(fù)效果最好，石油降解率達(dá)66.95%，而M2的石油降解率僅為5.02%。由于M3在修復(fù)過程中投入了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此土樣中有機(jī)質(zhì)和總氮含量大幅提高；而M2的各指標(biāo)變化則不如M3的明顯。M3中脫氫酶和過氧化氫酶活性最高，這是由于在修復(fù)過程中土壤微生物大量繁殖，微生物參與了石油烴的降解過程，使得脫氫酶和過氧化氫酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，說明土壤的氮元素轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，有利于土壤中微生物的生長(zhǎng)，為微生物參與石油烴的降解提供了充足的營(yíng)養(yǎng)條件。而M2中各種酶活性的變化均不如M3中明顯。M3在細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量方面均明顯高于M1和M2，接近于自然界中實(shí)際的微生物數(shù)量。
3、結(jié)論
a）實(shí)驗(yàn)室保藏的A，B，C，D4種高效石油降解菌均可提高微生物修復(fù)石油污染土壤的效果。單菌在40d修復(fù)過程中的修復(fù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出土著微生物，且4種單菌石油降解率的高低順序?yàn)椋篋>C>A>B。
b）4種菌混合除油的效果最好，在最佳配比（X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%）條件下，40d后土壤的石油降解率達(dá)54.50%。
c）菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg；在此條件下，40d后土壤的石油降解率達(dá)66.95%。
d）經(jīng)混合菌修復(fù)的石油污染土壤，其肥力明顯升高，脫氫酶、過氧化酶和脲酶的活性均升高，微生物數(shù)量也有明顯增加。
石油及其制品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和使用過程中產(chǎn)生的大量石油污染物進(jìn)入環(huán)境，對(duì)土壤造成了嚴(yán)重污染，因此對(duì)石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術(shù)中，與物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)技術(shù)因其修復(fù)效果好、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、降解過程迅速和無二次污染等特點(diǎn)，被廣泛采用。微生物修復(fù)技術(shù)的本質(zhì)是通過微生物的代謝活動(dòng)將污染物降解，修復(fù)過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復(fù)效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。
相比于正交設(shè)計(jì)，均勻設(shè)計(jì)的主要優(yōu)勢(shì)是：在因素和水平數(shù)均較多的情況下，用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)就可獲得期望的結(jié)果，節(jié)省人力和物力，便于實(shí)施。目前，國(guó)內(nèi)還少見將均勻設(shè)計(jì)法用于石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研究報(bào)道。本工作采用從東營(yíng)石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對(duì)模擬石油污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步從理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量方面比較了土壤經(jīng)微生物修復(fù)前后的變化，為東營(yíng)石油污染土壤微生物修復(fù)的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供了技術(shù)參考和理論支持。
1、實(shí)驗(yàn)部分
1.1材料、試劑和儀器
原油：山東省東營(yíng)市某煉油廠；土壤：山東省東營(yíng)市東營(yíng)未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經(jīng)破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質(zhì)量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲(chǔ)存在滅菌牛皮紙袋內(nèi)冷藏備用。
LB培養(yǎng)基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節(jié)細(xì)菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實(shí)驗(yàn)室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。
PHS-3型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；
721型可見光分光光度計(jì)：北京光學(xué)儀器廠。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.14種單菌與土著微生物石油降解率的比較
采用LB培養(yǎng)基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個(gè)錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個(gè)。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對(duì)照樣考察土著微生物的修復(fù)作用。每間隔一段時(shí)間取樣，采用重量法測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。
1.2.2優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定
對(duì)4種菌進(jìn)行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率，從而構(gòu)建出優(yōu)勢(shì)菌群。采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的配比進(jìn)行優(yōu)化。
1.2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取
5個(gè)影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設(shè)計(jì)考察各因素對(duì)修復(fù)效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。
1.3分析方法
1.3.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法
采用電位法測(cè)定土樣pH，水與土的體積比為2.5；重鉻酸鉀容量法測(cè)定模擬土樣的有機(jī)質(zhì)含量；半微量凱氏法測(cè)定模擬土樣的總氮含量；鉬銻抗比色法測(cè)定模擬土樣的總磷含量。
1.3.2土壤酶活性及微生物種群數(shù)量的測(cè)定
采用TTC法測(cè)定模擬土樣中脫氫酶的活性，奈氏比色法測(cè)定脲酶的活性，鄰苯三酚比色法測(cè)定多酚氧化酶的活性，高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶的活性；采用菌落形成單位CFU計(jì)數(shù)測(cè)定土壤的微生物種群數(shù)量。
2、結(jié)果與討論
2.14種單菌與土著微生物對(duì)石油降解率的影響
4種單菌與土著微生物對(duì)石油降解率的影響見圖1。由圖可見：使用4種單菌時(shí)石油降解率的高低順序?yàn)镈>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌處理40d后，石油降解率達(dá)30.08%，而土著微生物處理40d培養(yǎng)后的石油降解率僅為5.02%。
2.2優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定
混合菌的配比對(duì)石油降解率的影響見表1。由表1可見，當(dāng)A，B，C，D4種菌混合使用時(shí)，石油降解率最高，達(dá)到40.02%。
采用U11（114）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定A，B，C，D4種菌的最佳配比。U11（114）均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2，其中：X1為A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X2為B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X3為C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，X4為D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
U11（114）均勻?qū)嶒?yàn)的數(shù)據(jù)處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（1）。
方差分析表中顯著性水平為0.009<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。混合菌的最佳配比為：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，預(yù)測(cè)最高石油降解率為54.30%。在最佳配比條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，石油降解率為54.50%，與預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差為0.37%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的菌種配比準(zhǔn)確可信。
2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
采用U14（148）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究各培養(yǎng)條件對(duì)石油降解率的影響。U14（148）均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表3。其中：U1為混合菌接種量，U2為土壤含水率，U3為雞糞加入量，U4為麥糠加入量，U5為表面活性劑加入量。
U14（148）均勻?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)的處理采用UniformDesign2.10軟件，得出回歸方程見式（2）。
方差分析表中顯著性水平為0.001<0.01，回歸方程變量間關(guān)系是極顯著的。菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg，預(yù)測(cè)最高石油降解率為67.35%。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，石油降解率為66.95%，與預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差為0.59%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的誤差在允許范圍之內(nèi)，說明均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的菌群培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可信。
2.4微生物修復(fù)前后土壤性質(zhì)的對(duì)比
分別將未經(jīng)處理的模擬土樣、經(jīng)土著微生物通風(fēng)堆肥法處理的模擬土樣、經(jīng)混合菌處理（最佳配比及最優(yōu)培養(yǎng)條件下）的模擬土樣記作M1，M2，M3，考察微生物修復(fù)前后土壤理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量的變化。經(jīng)過不同處理的模擬土樣的性質(zhì)見表4。
由表4可見，M3的修復(fù)效果最好，石油降解率達(dá)66.95%，而M2的石油降解率僅為5.02%。由于M3在修復(fù)過程中投入了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此土樣中有機(jī)質(zhì)和總氮含量大幅提高；而M2的各指標(biāo)變化則不如M3的明顯。M3中脫氫酶和過氧化氫酶活性最高，這是由于在修復(fù)過程中土壤微生物大量繁殖，微生物參與了石油烴的降解過程，使得脫氫酶和過氧化氫酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，說明土壤的氮元素轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，有利于土壤中微生物的生長(zhǎng)，為微生物參與石油烴的降解提供了充足的營(yíng)養(yǎng)條件。而M2中各種酶活性的變化均不如M3中明顯。M3在細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量方面均明顯高于M1和M2，接近于自然界中實(shí)際的微生物數(shù)量。
3、結(jié)論
a）實(shí)驗(yàn)室保藏的A，B，C，D4種高效石油降解菌均可提高微生物修復(fù)石油污染土壤的效果。單菌在40d修復(fù)過程中的修復(fù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出土著微生物，且4種單菌石油降解率的高低順序?yàn)椋篋>C>A>B。
b）4種菌混合除油的效果最好，在最佳配比（X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%）條件下，40d后土壤的石油降解率達(dá)54.50%。
c）菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：混合菌接種量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、雞糞加入量90g/kg、麥糠加入量150g/kg和表面活性劑加入量22mL/kg；在此條件下，40d后土壤的石油降解率達(dá)66.95%。
d）經(jīng)混合菌修復(fù)的石油污染土壤，其肥力明顯升高，脫氫酶、過氧化酶和脲酶的活性均升高，微生物數(shù)量也有明顯增加。
